Анна Михалкова родилась 14 мая 1974 года в Москве, в одной из самых известных российских творческих династий. Прапрадед — великий русский живописец Василий Суриков, прадед — народный художник РСФСР Пётр Кончаловский. Дедушка — Сергей Владимирович Михалков — известный поэт и писатель, автор текстов Государственных гимнов СССР и России, а бабушка, Наталья Кончаловская, была литератором и переводчицей. Отец — кинорежиссёр Никита Михалков, мать — Президент Благотворительного фонда «Русский Силуэт» Татьяна Михалкова.
Аня мечтала стать актрисой с детства, брала уроки актёрского мастерства. Однако после школы, в 1991 году, продолжила свое образование сначала в Швейцарии, затем в Италии, где изучала историю искусств. И всё же, вернувшись в Москву, поступила на актёрский факультет во ВГИК, в мастерскую Народного артиста РСФСР Анатолия Ромашина, и окончила его в 1997 году по специальности «Артист драматического театра и кино». После получения высшего актёрского образования училась на юридическом факультете МГИМО по специальности «Международное право».
Сниматься в кино Аня начала в юном возрасте. В 1993 году вышел документальный фильм-эксперимент ее отца — «Анна. От 6 до 18». Никита Михалков в течение 12 лет задавал дочери одни и те же вопросы, сравнивая, как с годами на фоне исторических событий в стране, менялось мировоззрение ребёнка. Лента получила множество наград на различных кинофестивалях.
Фильмография актрисы насчитывает больше пятидесяти картин, среди них: «Ревизор» Сергея Газарова, «Небо в алмазах» Василия Пичула, «Лицо французской национальности» Ильи Хотиненко, «Изображая жертву» Кирилла Серебренникова, «Обитаемый остров» Федора Бондарчука, «ПираМММида» Эльдара Салаватова, «Распутин» Жозе Дайана и Ираклия Квирикадзе и многие другие.
Анна Михалкова создала на экране множество характерных образов, за что неоднократно получала награды на международных кинофестивалях. В её копилке несколько «Золотых орлов», «Ника», ТЭФИ и премия лучшей актрисы на фестивале сериалов Series Mania (Лилль).
Михалкова не только активно снимается в кино, но и успешно пробует себя в качестве продюсера. Первым самостоятельным проектом Анны стал триллер Леонида Рыбакова «Скажи ЛЕО» о реальном и виртуальном мире. В 2009 году с режиссёром Игорем Волошиным Михалкова выпустила боевик «Я». Позже Анна приняла участие в создании мелодрамы Алисы Хмельницкой и Резо Гигинеишвили «Без мужчин». А в 2014 году выпустила детский комедийный фильм «Федька» в сотворчестве с Любовью Андреевой. Также Анна стала одним из создателей и продюсером кинооператорской премии «Белый квадрат», которая вручается ежегодно Гильдией кинооператоров России за лучшую операторскую работу в полнометражных художественных фильмах
С 2002 года Анна Михалкова ведёт программу «Спокойной ночи, малыши!». Будучи мамой и понимая всю ответственность, Анна не сразу дала свое согласие на эту работу: «Всегда думала, что телевидение — не моя среда. Но дети тогда были маленькими, и, в конце концов, я подумала, что им будет приятно. Поначалу было сложно влиться в команду, общаться на камеру. В кино ведь ее не замечаешь, а тут с ней надо взаимодействовать. Постепенно привыкла — и к камере, и к людям. Я люблю детей, для меня чрезвычайно важна тема детства вообще, и я работаю в этой программе не для того, чтобы заработать деньги. У меня есть принципиальная позиция: помогать детям, потому что в нашей стране для них практически ничего не делается!»
В 2019 Анне Михалковой вручена Российская национальная премия в области детского кино и телевидения «ТЭФИ-KIDS» в номинации «Лучшая ведущая телевизионной программы для детей».